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本试剂盒采用高效标记的探针和敏感性加强型原位杂交检测试剂盒，原位杂交实验的成功率大大提高，操作简便。

• 有条件应尽可能用新鲜标本，并及时进行固定。固定液为4%多聚甲醛(0.1MPBS，PH7.0～7.6)含0.1%DEPC。因为mRNA类基因容易降解。
  
• 标本的消化对原位杂交比较重要，适当的消化将使靶基因充分暴露，增加探针的接触性。但过度的消化将使标本明显减薄乃至消失。不同的标本对消化的敏感性不同。常用的消化酶有蛋白酶K和胃蛋白酶。大量标本实验前，应仔细摸索最佳的消化条件。蛋白酶K的消化条件为10μg/mL(0.1M TBS,PH7.2～7.6)，37℃消化1～5分钟。
  
• 杂交后的洗涤对信号/背景/强度有密切关系，洗涤时间越短，信号越强，背景也越高；洗涤时间超长，信号越低。适当的洗涤时间会获得理想的信号强度和可以忽略的背景染色。

工作量：100张切片
特异性：人
标记方式：3’—尾段标记

组分	规格
胃蛋白酶(×10;Pepsin)	2mL
预杂交液	2mL
Prolactin mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液	2mL
封闭液	5mL
生物素化鼠抗地高辛	5mL
SABC-POD	5mL
生物素化过氧化物酶	5mL

保存：4℃，有效期一年

• 原位杂交专用盖玻片；
  
• POLY-L-LYSINE；
  
• DEPC；
  
• 20%甘油
  
• 缓冲液(3%柠檬酸，2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC，原位杂交用PBS)

一．培养细胞和冰冻切片

• 准备工作：
  固定液：4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)；1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)
  3%柠檬酸：100mL蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0左右。
  2×SSC：1000mL蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量294)8.8g。
  0.5×SSC：300mL蒸馏水加100mL 2×SSC即可。
  0.2×SSC：270mL蒸馏水加30mL 2×SSC即可。
  20%甘油：20mL甘油加80mL蒸馏水即可。
  原位杂交用PBS(1000mL蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g),PH7.2～7.6。
  
• 操作程序：
  注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
  
  • 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10～20μm。
    
  • 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
    
  • 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
    
  • 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
    
  • 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5～120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
    
  • 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
    
  • 预杂交：湿盒的准备：干的杂交盒底部加20%甘油20mL以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38～42℃2～4小时。吸取多余液体，不洗。
    
  • 杂交：按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38～42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
    
  • 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次;37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1～2次)。
    
  • 滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
    
  • 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
    
  • 滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
    
  • 滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
    
  • DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1mL蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20～30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
    
  • 必要时苏木素复染，充分水洗。
    
  • 酒精脱水，二甲苯透明，封片。

二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.0～7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30～40分钟，一般不要超过1小时。

• 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6～8μm。
  
• 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
  
• 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5～10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
  
• 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟，10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6～16步相同。

Prolactin的细胞胞浆着色呈棕黄色。


由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2～10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。
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